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从零到2000%：全新DMD基因疗法实现史诗逆转！
0 人阅读发布时间：2026-06-24 10:12
杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种进行性肌肉萎缩疾病，发病原因是DMD基因突变导致抗肌萎缩蛋白缺失。因此，基因疗法在DMD治疗方面展现出巨大潜力。2026年6月11日，北京大学深圳研究院/深圳湾实验室Andrew S. Lee教授团队、德克萨斯大学安德森癌症中心Betty Y.S. Kim教授团队和中国医学科学院阜外医院兰峰教授团队等在Nature Biomedical Engineering上发表了题为“Skeletal-muscle-targeted non-viral delivery of full-length DMD mRNA for Duchenne muscular dystrophy”的研究论文。该研究开发了工程化靶向性细胞外囊泡（t-EV），通过静脉给药实现全长DMD mRNA的骨骼肌特异性递送，并呈剂量依赖性恢复抗肌萎缩蛋白表达，在小鼠与非人灵长类动物中均显示出良好安全性与肌肉功能改善。在此基础上，研究团队进一步启动了首次人体临床试验，成功实现全长DMD mRNA的患者骨骼肌递送，初步观察到抗肌萎缩蛋白表达提升与肌肉功能改善。
南模生物为该研究提供了Dmd-Q995X小鼠模型。
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DMD疗法新思路：基于EV的非病毒mRNA递送
当前DMD治疗面临诸多限制：反义寡核苷酸疗法可促进外显子跳跃，但仅适用于部分患者，且治疗后全长抗肌萎缩蛋白恢复水平通常不足基线10%，长期疗效存疑；腺相关病毒（AAV）基因疗法受限于约14 kb的载体容量，无法递送全长DMD基因，只能使用截短抗肌萎缩蛋白，并且AAV免疫原性已导致严重不良事件乃至患者死亡；mRNA疗法因能以非整合方式实现短暂蛋白表达，成为一种有前景的替代策略，但如何将mRNA经体循环高效递送至骨骼肌仍是待解决的关键难题。
细胞外囊泡（EVs）凭借其低免疫原性、可重复给药、可工程化修饰及装载大片段核酸等优势，为突破这一递送瓶颈提供了可能。为此，研究者采用改良精密电穿孔系统，以新生儿真皮成纤维细胞为来源，高效制备装载全长人抗肌萎缩蛋白mRNA的工程化细胞外囊泡（DMD EV mRNA），产量较传统方法提高15倍以上，每个囊泡平均携带5-8个mRNA拷贝，远超常规电穿孔效率。所获囊泡呈现典型外泌体特征，无质粒DNA或胞外游离mRNA污染。在抗肌萎缩蛋白缺陷的mdx小鼠原代成肌细胞中，DMD EV mRNA处理以剂量依赖方式使抗肌萎缩蛋白表达恢复至野生型水平，证实该策略可实现全长mRNA的有效递送与功能性蛋白恢复，为后续体内系统给药和临床转化奠定了关键技术基础。
图1. 全长DMD EV mRNA可在体外恢复肌肉中的肌营养不良蛋白表达。
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靶向EVs可实现针对骨骼肌的mRNA递送
为实现全长DMD mRNA在体内的骨骼肌靶向递送，研究者对细胞外囊泡（EVs）进行了工程化靶向改造。CD47是EVs表面高丰度的跨膜蛋白，兼具减少肝脏摄取的作用。基于整合素-配体识别原理，研究者筛选了一组均含有Arg-Gly-Asp（RGD）基序的高度保守7-mer肽序列，将其融合至CD47的N端，以赋予EVs主动靶向骨骼肌的能力，构建了靶向性细胞外囊泡（t-EV）。经Pull-down实验与结构评估证实，肽段成功展示于EV外表面且囊泡完整性未受影响。体外与体内靶向性实验表明，t-EV可显著增强成肌细胞摄取，并能在静脉注射后48小时内优先富集于骨骼肌，其中心脏、肝脏等非靶组织的分布明显减少，优于脂质纳米颗粒（LNP）。其中，t7与t9肽修饰的t-EV骨骼肌选择性最优。机制研究进一步揭示，整合素αVβ6是介导t9-EV被成肌细胞特异性摄取的关键受体，其在骨骼肌中的表达高于心肌，从分子层面解释了t-EV对骨骼肌的高选择性及对心肌的低嗜性。进入细胞后，t-EV主要通过脂筏和巨胞饮途径实现摄取，并表现出优于靶向LNP的溶酶体逃逸能力。综上，t-EV通过整合素αVβ6介导的识别机制，实现了全长抗肌萎缩蛋白在骨骼肌中的选择性表达。
图2. 经改良的靶向骨骼肌的t-EV在体外和体内验证。
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DMD t-EV可实现抗肌萎缩蛋白的正确表达与组织分布
为评估DMD t-EV经全身给药后介导的抗肌萎缩蛋白表达与组织分布，研究者以抗肌萎缩蛋白缺陷的Dmd-Q995X（mdx）小鼠为模型，联合免疫抑制剂FK506，对DMD t-EV采用静脉注射给药，设置三个递增剂量（低剂量：1.5×1010拷贝；中剂量：3×1010拷贝；高剂量：6×1010拷贝），给药频率为每周两次，持续4周。第30天取骨骼肌及主要器官进行蛋白分析。结果显示，DMD t-EV联合FK506处理使抗肌萎缩蛋白水平呈剂量依赖性升高。低、中剂量下，蛋白表达局限于骨骼肌，未见于非肌肉器官；高剂量下，蛋白仍主要定位于骨骼肌，但在肝脏和脾脏中可检测到低水平表达。上述结果证实了t-EV平台的骨骼肌靶向特异性及其剂量-效应关系。
图3. 静脉注射的DMD t-EVs可在体内恢复骨骼肌的的抗肌萎缩蛋白。
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DMD t-EVs的体内疗效
在证实t-EV能够介导抗肌萎缩蛋白表达后，研究者进一步评估了其长期治疗对肌肉功能的恢复效果。以抗肌萎缩蛋白缺陷的mdx小鼠为模型，在联合或不联合FK506免疫抑制的条件下，每3天静脉注射一次DMD t-EV，持续4个月。治疗期间，骨骼肌中抗肌萎缩蛋白含量逐步增加，蛋白定位与形态接近野生型小鼠，血清肌酸激酶显著下降。功能改善方面，早在治疗第2周即观察到握力增强、跑步时间延长、耐力提升及自主跑轮活动增加，且效果持续至研究结束。安全性方面，治疗期间未见明显毒性反应，肝脏与肾脏组织学、全身炎症及器官损伤标志物均无异常；外周免疫细胞亚群及多器官炎症因子水平也与对照组无差异；剂量递增实验亦未引起血常规/生化指标显著改变。
在载体免疫原性比较中，研究者将鼠源C2C12细胞制备的t-EV与AAV9-微型抗肌萎缩蛋白分别肌肉注射至mdx小鼠。AAV组在注射后24小时出现明显白细胞浸润，第7天脾脏中IFNγ阳性CD8 T细胞增多，提示系统性T细胞活化；而t-EV组未引发明显免疫反应。合FK506的DMD t-EV治疗组在握力、抽搐力、强直力、疲劳时间和抗疲劳能力上均显著优于AAV9-microdystrophin靶向及非靶向组，且骨骼肌抗肌萎缩蛋白表达水平更高。上述结果表明，相较于AAV递送系统，DMD t-EV递送系统在mdx模型中展现出更优的蛋白表达水平与更好的安全治疗效果。
图4. 与AAV-微型抗肌萎缩蛋白相比，在mdx小鼠中静脉注射DMD t-EVs可提高肌营养不良蛋白的表达并恢复肌肉功能。
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在非人灵长类动物中对DMD t-EVs的评估
为进一步验证DMD t-EV在更大动物模型中的有效性与安全性，研究者选用野生型狨猴开展了非人灵长类动物实验。实验期间每日给予FK506，并每3天静脉注射一次DMD t-EV，持续19天。在靶向性方面，t-EV优先蓄积于主要骨骼肌群，脱靶分布显著低于非靶向EVs。在蛋白表达方面，抗肌萎缩蛋白在肌纤维中定位正确，外源性蛋白约占肌肉总抗肌萎缩蛋白的25–50%，表达可持续超过30天，且呈剂量依赖性：高剂量组骨骼肌抗肌萎缩蛋白较对照组提升约48.9%，约为低剂量组（22.3%）的两倍。在安全性方面，DMD t-EV联合FK506未引起全身毒性，组织学、肝肾功能指标、血常规及体重均维持正常，而高剂量AAV处理则出现多项指标异常，与其已知毒性一致。上述结果再次证明了DMD t-EV联合FK506给药策略的有效性与安全性，展现出该疗法成为DMD基因疗法的转化潜力。
图5. DMD t-EVs可在非人灵长类动物的骨骼肌中实现抗肌萎缩蛋白表达提升与肌肉功能改善。
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文献以外的临床转化
上述非人灵长类实验即为本篇文献中临床前药效与安全性验证的终点。在完成文献所述研究后，研究团队进一步推进了临床转化，启动了人体临床试验。该试验初步评估SPOT-03（即DMD t-EV）在DMD患儿中的安全性与耐受性。试验计划纳入6-9例2-8岁确诊DMD男童，分为两个给药方案组：均以4.0×1011拷贝/kg的剂量静脉输注，每4天一次，第一组8次（4周），第二组32次（16周），均联合口服他克莫司进行免疫调节。首批入组的两例患者完成8次给药后，抗肌萎缩蛋白水平分别提升超过1000%和2000%，肌肉功能改善在停药后可持续达6个月。这是全球首次在人体中实现非病毒全长抗肌萎缩蛋白的骨骼肌靶向递送。该结果初步验证了这一平台的临床转化潜力，其疗效与安全性尚需在更大样本及更长治疗周期中进一步评估。
关于我们
上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。